Javascript зараз вимкнено у вашому браузері.Якщо javascript вимкнено, деякі функції цього сайту не працюватимуть.
Хав’єр Фідальго, * П’єр-Антуан Деглесне, * Родріго Арройо, * Ліліан Сепульведа, * Євгенія Раннева, Департамент науки Філіпа Депре, Skin Tech Pharma Group, Кастелло Д'Емпурієс, Каталонія, Іспанія * Ці автори мають певну думку про цю роботу Equal довідка: Гіалуронова кислота (ГК) — це природний полісахарид, який використовується у виробництві шкірних наповнювачів для естетичних цілей.Оскільки період напіврозпаду в тканинах людини становить кілька днів, шкірні наповнювачі на основі ГК хімічно модифіковані, щоб подовжити їх життя в організмі.Найбільш поширеною модифікацією комерційних наповнювачів на основі ГК є використання 1,4-бутандіол дигліцидилового ефіру (BDDE) як зшиваючого агента для зшивання ланцюгів ГК.Залишковий або непрореагував BDDE вважається нетоксичним при <2 частинах на мільйон (ppm);отже, залишковий BDDE в кінцевому шкірному наповнювачі необхідно кількісно визначити, щоб гарантувати безпеку пацієнта.Матеріали та методи: це дослідження описує виявлення та характеристику побічного продукту реакції зшивання між BDDE та HA в лужних умовах шляхом поєднання рідинної хроматографії та мас-спектрометрії (LC-MS).Результати: після різних аналізів було виявлено, що лужні умови та висока температура, які використовуються для дезінфекції гідрогелю HA-BDDE, сприяли утворенню цього нового побічного продукту, «пропіленгліколеподібної» сполуки.Аналіз РХ-МС підтвердив, що побічний продукт має таку саму моноізотопну масу, як і BDDE, інший час утримування (tR) і інший режим ультрафіолетового поглинання (λ=200 нм).На відміну від BDDE, під час аналізу РХ-МС було виявлено, що за однакових умов вимірювання цей побічний продукт має вищу швидкість виявлення при 200 нм.Висновок: ці результати показують, що в структурі цієї нової сполуки немає епоксиду.Обговорення відкрите для оцінки ризику цього нового побічного продукту, який виявляється у виробництві гідрогелю HA-BDDE (дермального наповнювача HA) для комерційних цілей.Ключові слова: гіалуронова кислота, ГК дермальний наповнювач, зшита гіалуронова кислота, BDDE, РХ-МС аналіз, побічний продукт BDDE.
Філлери на основі гіалуронової кислоти (ГК) є найпоширенішими і популярними шкірними наповнювачами, які використовуються в косметичних цілях.1 Цей дермальний наповнювач є гідрогелем, який зазвичай складається з >95% води та 0,5-3% ГК, що надає їм гелеподібну структуру.2 ГК є полісахаридом і основним компонентом позаклітинного матриксу хребетних.Один з інгредієнтів.Він складається з (1,4)-глюкуронової кислоти-β (1,3)-N-ацетилглюкозаміну (GlcNAc) повторюваних дисахаридних одиниць, з’єднаних глікозидними зв’язками.Ця схема дисахаридів однакова в усіх організмах.Порівняно з деякими білковими наповнювачами (такими як колаген), ця властивість робить ГК дуже біосумісною молекулою.Ці наповнювачі можуть проявляти специфічність амінокислотної послідовності, яку може розпізнати імунна система пацієнта.
При використанні в якості дермального наповнювача основним обмеженням ГК є її швидкий обмін у тканинах через присутність специфічного сімейства ферментів, які називаються гіалуронідазами.До цього часу було описано кілька хімічних модифікацій у структурі ГК для збільшення періоду напіврозпаду ГК у тканинах.3 Більшість цих модифікацій намагаються зменшити доступ гіалуронідази до полісахаридних полімерів шляхом зшивання ланцюгів ГК.Таким чином, завдяки утворенню містків і міжмолекулярних ковалентних зв’язків між структурою ГК і зшиваючим агентом, зшитий гідрогель ГК виробляє більше продуктів антиферментного розпаду, ніж природний ГК.4-6
Поки що хімічні зшиваючі агенти, що використовуються для отримання зшитої ГК, включають метакриламід, 7-гідразид, 8-карбодиімід, 9-дівінілсульфон, 1,4-бутандіол дигліцидиловий ефір (BDDE) і полі(етиленгліколь) дигліцидиловий ефір.10,11 BDDE на даний момент є найбільш часто використовуваним зшиваючим агентом.Хоча ці типи гідрогелів були доведені як безпечні протягом десятиліть, використовувані зшиваючі агенти є реактивними реагентами, які можуть бути цитотоксичними та, в деяких випадках, мутагенними.12 Тому їх залишковий вміст у кінцевому гідрогелі має бути високим.BDDE вважається безпечним, якщо залишкова концентрація становить менше 2 частин на мільйон (ppm).4
Існує кілька методів визначення концентрації низького залишку BDDE, ступеня зшивання та положення заміщення в гідрогелях ГК, таких як газова хроматографія, ексклюзійна хроматографія в поєднанні з мас-спектрометрією (МС), методи вимірювання флуоресценції ядерного магнітного резонансу (ЯМР) та Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) зі зв’язаною діодною матрицею.13-17 У цьому дослідженні описується виявлення та характеристика побічного продукту в остаточному зшитому гідрогелі ГК, утвореному реакцією BDDE та ГК у лужних умовах.ВЕРХ та рідинна хроматографія-мас-спектрометрія (LC-MS аналіз).Оскільки токсичність цього побічного продукту BDDE невідома, ми рекомендуємо визначати кількісне визначення його залишків подібним до методу, який зазвичай використовують для BDDE у кінцевому продукті.
Отримана натрієва сіль ГК (Shiseido Co., Ltd., Токіо, Японія) має молекулярну масу ~1 368 000 Да (метод Лорана) 18 і характеристичну в’язкість 2,20 м3/кг.Для реакції зшивання BDDE (≥95%) було придбано у Sigma-Aldrich Co. (Сент-Луїс, Миссурі, США).Забуферений фосфатом фізіологічний розчин з pH 7,4 був придбаний у компанії Sigma-Aldrich.Усі розчинники, ацетонітрил і вода, використані в РХ-МС-аналізі, були придбані у ВЕРХ-класу якості.Мурашина кислота (98%) закуповується х.ч.
Усі експерименти проводили на системі UPLC Acquity (Вотерс, Мілфорд, Массачусетс, США) і підключали до потрійного квадрупольного мас-спектрометра API 3000, оснащеного джерелом іонізації з електророзпиленням (AB SCIEX, Фремінгем, Массачусетс, США).
Синтез зшитого гідрогелю ГК розпочали додаванням 198 мг BDDE до 10% (мас./мас.) розчину гіалуронату натрію (NaHA) у присутності 1% лугу (гідроксид натрію, NaOH).Кінцева концентрація BDDE в реакційній суміші становила 9,9 мг/мл (0,049 мМ).Потім реакційну суміш ретельно перемішують і гомогенізують і залишають на 4 години при 45°C.19 рН реакції підтримується на рівні ~12.
Після цього реакційну суміш промивали водою, а кінцевий гідрогель HA-BDDE фільтрували та розбавляли буфером PBS для досягнення концентрації HA від 10 до 25 мг/мл і кінцевого рН 7,4.Щоб стерилізувати отримані зшиті гідрогелі ГК, усі ці гідрогелі автоклавують (120°C протягом 20 хвилин).Очищений гідрогель BDDE-HA зберігається при 4°C до аналізу.
Для аналізу BDDE, присутнього в продукті зшитої ГК, зважили зразок 240 мг і внесли в центральний отвір (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, США; об’єм 0,5 мл) і центрифугували при 10 000 об/хв при кімнатній температурі. 10 хвилин.Було зібрано та проаналізовано загалом 20 мкл рідини, що витягується.
Для аналізу стандарту BDDE (Sigma-Aldrich Co) у лужних умовах (1%, 0,1% та 0,01% NaOH), якщо виконуються наступні умови, рідкий зразок становить 1:10, 1:100 або до 1:1 000 000 Якщо необхідно, використовуйте для аналізу деіонізовану воду MilliQ.
Для вихідних матеріалів, використаних у реакції зшивання (HA 2%, H2O, 1% NaOH і 0,049 мМ BDDE), 1 мл кожного зразка, приготованого з цих матеріалів, аналізували з використанням тих самих умов аналізу.
Щоб визначити специфічність піків, що з’являються на іонній карті, 10 мкл 100 ppb стандартного розчину BDDE (Sigma-Aldrich Co) додали до 20 мкл зразка.У цьому випадку кінцева концентрація стандарту в кожному зразку становить 37 ppb.
Спочатку приготуйте вихідний розчин BDDE з концентрацією 11 000 мг/л (11 000 ppm), розвівши 10 мкл стандартного BDDE (Sigma-Aldrich Co) 990 мкл води MilliQ (щільність 1,1 г/мл).Використовуйте цей розчин для приготування розчину BDDE 110 мкг/л (110 ppb) як проміжного стандартного розведення.Потім використовуйте проміжний стандартний розчинник BDDE (110 ppb), щоб підготувати стандартну криву, розбавивши проміжний розчинник кілька разів, щоб досягти бажаної концентрації 75, 50, 25, 10 і 1 ppb.Як показано на малюнку 1, виявлено, що стандартна крива BDDE від 1,1 до 110 ppb має хорошу лінійність (R2>0,99).Стандартну криву повторювали в чотирьох незалежних експериментах.
Рисунок 1 Стандартна калібрувальна крива BDDE, отримана методом РХ-МС, на якій спостерігається хороша кореляція (R2>0,99).
Скорочення: BDDE, 1,4-бутандіол дигліцидиловий ефір;РХ-МС, рідинна хроматографія та мас-спектрометрія.
Для ідентифікації та кількісного визначення стандартів BDDE, присутніх у зшитому ГК, і стандартів BDDE в базовому розчині, використовувався аналіз РХ-МС.
Хроматографічне розділення було досягнуто на колонці LUNA 2,5 мкм C18(2)-HST (50×2,0 мм2; Phenomenex, Торранс, Каліфорнія, США) і зберігалося при кімнатній температурі (25°C) під час аналізу.Рухома фаза складається з ацетонітрилу (розчинник А) і води (розчинник Б), що містить 0,1 % мурашиної кислоти.Рухома фаза елююється градієнтним елююванням.Градієнт такий: 0 хвилин, 2% A;1 хвилина, 2% A;6 хвилин, 98% A;7 хвилин, 98% A;7,1 хвилини, 2% A;10 хвилин, 2% A. Час роботи становить 10 хвилин, а об’єм ін’єкції становить 20 мкл.Час утримування BDDE становить близько 3,48 хвилин (від 3,43 до 4,14 хвилин на основі експериментів).Рухому фазу закачували зі швидкістю потоку 0,25 мл/хв для аналізу РХ-МС.
Для аналізу BDDE та кількісного визначення за допомогою MS система UPLC (Waters) поєднується з потрійним квадрупольним мас-спектрометром API 3000 (AB SCIEX), оснащеним джерелом іонізації з електророзпиленням, і аналіз виконується в режимі позитивних іонів (ESI+).
Відповідно до аналізу іонних фрагментів, виконаного на BDDE, було визначено, що фрагмент із найвищою інтенсивністю відповідає 129,1 Да (рис. 6).Таким чином, у режимі багатоіонного моніторингу (MIM) для кількісного визначення перетворення маси (співвідношення маси до заряду [m/z]) BDDE становить 203,3/129,1 Да.Він також використовує режим повного сканування (FS) і режим іонного сканування продукту (PIS) для аналізу LC-MS.
Для перевірки специфічності методу аналізували порожню пробу (початкова рухома фаза).У холостому зразку з конверсією маси 203,3/129,1 Да не виявлено сигналу.Що стосується повторюваності експерименту, було проаналізовано 10 стандартних ін’єкцій 55 ppb (у середині калібрувальної кривої), що призвело до залишкового стандартного відхилення (RSD) <5% (дані не показані).
Залишковий вміст BDDE був кількісно визначений у восьми різних автоклавованих гідрогелях BDDE зшитих ГК, що відповідає чотирьом незалежним експериментам.Як описано в розділі «Матеріали та методи», кількісне визначення оцінюється за середнім значенням кривої регресії стандартного розведення BDDE, що відповідає унікальному піку, виявленому при переході маси BDDE 203,3/129,1 Да, із збереженням час від 3.43 до 4.14 хв. Не чекаючи.На малюнку 2 показано приклад хроматограми еталонного стандарту BDDE 10 ppb.У таблиці 1 наведено залишковий вміст BDDE у восьми різних гідрогелях.Діапазон значень становить від 1 до 2,46 ppb.Таким чином, залишкова концентрація BDDE у зразку прийнятна для використання людиною (<2 ppm).
Рисунок 2 Іонна хроматограма 10 ppb еталонного стандарту BDDE (Sigma-Aldrich Co), перехід MS (m/z), отриманий за допомогою аналізу LC-MS 203,30/129,10 Да (у позитивному режимі MRM).
Скорочення: BDDE, 1,4-бутандіол дигліцидиловий ефір;РХ-МС, рідинна хроматографія та мас-спектрометрія;MRM, моніторинг множинної реакції;MS, маса;m/z, відношення маси до заряду.
Примітка: Зразки 1-8 є автоклавованими BDDE-гідрогелями ГК.Також повідомляється про залишкову кількість BDDE в гідрогелі та пік часу утримання BDDE.Нарешті, також повідомляється про існування нових піків з різними часами утримання.
Скорочення: BDDE, 1,4-бутандіол дигліцидиловий ефір;ГК, гіалуронова кислота;MRM, моніторинг множинної реакції;tR, час утримання;РХ-МС, рідинна хроматографія та мас-спектрометрія;RRT, відносний час утримання.
Дивно, але аналіз іонної хроматограми LC-MS показав, що на основі всіх проаналізованих зразків гідрогелю гідрогелю, отриманого в автоклаві, спостерігався додатковий пік при більш короткому часі утримання від 2,73 до 3,29 хвилин.Наприклад, на малюнку 3 показано іонну хроматограму поперечно-зшитого зразка ГК, де додатковий пік з’являється при іншому часі утримування приблизно 2,71 хвилини.Було виявлено, що спостережуваний відносний час утримування (RRT) між щойно спостережуваним піком і піком BDDE становить 0,79 (таблиця 1).Оскільки ми знаємо, що нещодавно спостережений пік менше зберігається в колонці C18, яка використовується в аналізі LC-MS, новий пік може відповідати більш полярній сполукі, ніж BDDE.
Рисунок 3. Іонна хроматограма зразка гідрогелю зшитої ГК, отриманої за допомогою РХ-МС (перетворення маси MRM 203,3/129,0 Да).
Скорочення: ГК, гіалуронова кислота;РХ-МС, рідинна хроматографія та мас-спектрометрія;MRM, моніторинг множинної реакції;RRT, відносний час утримання;tR, час утримання.
Щоб виключити можливість того, що нові спостережувані піки можуть бути забруднювачами, які спочатку були присутні у використаній сировині, цю сировину також проаналізували за допомогою того самого методу аналізу РХ-МС.Проаналізовані вихідні матеріали включають воду, 2% NaHA у воді, 1% NaOH у воді та BDDE у тій самій концентрації, що використовується в реакції зшивання.Іонна хроматограма використаного вихідного матеріалу не показала жодної сполуки чи піку, а час її утримання відповідає новому спостережуваному піку.Цей факт відкидає ідею про те, що не тільки вихідний матеріал може містити будь-які сполуки або речовини, які можуть перешкоджати процедурі аналізу, але й немає ознак можливого перехресного забруднення іншими лабораторними продуктами.Значення концентрації, отримані після РХ-МС аналізу BDDE та нових піків, наведені в таблиці 2 (зразки 1-4), а іонна хроматограма на малюнку 4.
Примітка: Зразки 1-4 відповідають сировині, яка використовується для виробництва автоклавних гідрогелів BDDE зшитого ГК.Ці зразки не були автоклавовані.
Скорочення: BDDE, 1,4-бутандіол дигліцидиловий ефір;ГК, гіалуронова кислота;РХ-МС, рідинна хроматографія та мас-спектрометрія;MRM, моніторинг множинної реакції.
Малюнок 4 відповідає LC-MS хроматограмі зразка сировини, яка використовується в реакції зшивання HA та BDDE.
Примітка: усі вони вимірюються в тій самій концентрації та співвідношенні, які використовуються для проведення реакції зшивання.Числа для сировини, проаналізованої на хроматограмі, відповідають: (1) воді, (2) 2% водному розчину ГК, (3) 1% водному розчину NaOH.Аналіз LC-MS виконується для конверсії маси 203,30/129,10 Да (у позитивному режимі MRM).
Скорочення: BDDE, 1,4-бутандіол дигліцидиловий ефір;ГК, гіалуронова кислота;РХ-МС, рідинна хроматографія та мас-спектрометрія;MRM, моніторинг множинної реакції.
Досліджено умови, що призвели до утворення нових піків.Щоб дослідити, як умови реакції, що використовуються для отримання зшитого гідрогелю ГК, впливають на реакційну здатність зшиваючого агента BDDE, що призводить до утворення нових піків (можливих побічних продуктів), було проведено різні вимірювання.У цих визначеннях ми вивчили та проаналізували кінцевий зшивач BDDE, який обробляли різними концентраціями NaOH (0%, 1%, 0,1% і 0,01%) у водному середовищі з подальшим автоклавуванням або без нього.Процедура бактерій для імітації тих самих умов є такою ж, як і метод, який використовується для отримання зшитого гідрогелю ГК.Як описано в розділі «Матеріали та методи», перехід маси зразка аналізували за допомогою LC-MS до 203,30/129,10 Да.Розраховується BDDE та концентрація нового піку, а результати наведено в таблиці 3. У зразках, які не були автоклавовані, нових піків не виявлено, незалежно від присутності NaOH у розчині (зразки 1-4, табл. 3).Для автоклавованих зразків нові піки виявляються лише за наявності NaOH у розчині, і утворення піку, здається, залежить від концентрації NaOH у розчині (зразки 5-8, таблиця 3) (RRT = 0,79).На малюнку 5 наведено приклад іонної хроматограми, що показує два автоклавованих зразки в присутності або за відсутності NAOH.
Скорочення: BDDE, 1,4-бутандіол дигліцидиловий ефір;РХ-МС, рідинна хроматографія та мас-спектрометрія;MRM, моніторинг множинної реакції.
Примітка. Верхня хроматограма: зразок обробляли 0,1% водним розчином NaOH і автоклавували (120°C протягом 20 хвилин).Нижня хроматограма: зразок не обробляли NaOH, а автоклавували за тих же умов.Перетворення маси 203,30/129,10 Да (у позитивному режимі MRM) аналізували за допомогою РХ-МС.
Скорочення: BDDE, 1,4-бутандіол дигліцидиловий ефір;РХ-МС, рідинна хроматографія та мас-спектрометрія;MRM, моніторинг множинної реакції.
У всіх автоклавованих зразках, з NaOH або без нього, концентрація BDDE була значно знижена (до 16,6 разів) (зразки 5-8, табл. 2).Зменшення концентрації BDDE може бути пов’язане з тим, що при високих температурах вода може діяти як основа (нуклеофіл) для розкриття епоксидного кільця BDDE з утворенням 1,2-діолової сполуки.Моноізотопна якість цієї сполуки відрізняється від якості BDDE, і тому це не вплине.РХ-МС виявив зсув маси 203,30/129,10 Да.
Нарешті, ці експерименти показують, що генерація нових піків залежить від присутності BDDE, NAOH і процесу автоклавування, але не має нічого спільного з ГК.
Потім новий пік, виявлений за часу утримування приблизно 2,71 хвилини, характеризувався за допомогою РХ-МС.Для цього BDDE (9,9 мг/мл) інкубували в 1% водному розчині NaOH і автоклавували.У таблиці 4 характеристики нового піку порівнюються з відомим контрольним піком BDDE (час утримування приблизно 3,47 хвилини).На основі аналізу іонної фрагментації двох піків можна зробити висновок, що пік із часом утримування 2,72 хвилини демонструє ті самі фрагменти, що й пік BDDE, але з іншою інтенсивністю (рис. 6).Для піку, що відповідає часу утримання (PIS) 2,72 хвилини, більш інтенсивний пік спостерігався після фрагментації при масі 147 Да.При концентрації BDDE (9,9 мг/мл), використаній у цьому визначенні, також спостерігалися різні режими поглинання (УФ, λ=200 нм) в ультрафіолетовому спектрі після хроматографічного розділення (рис. 7).Пік із часом утримання 2,71 хвилини все ще видно при 200 нм, тоді як пік BDDE не можна спостерігати на хроматограмі за тих самих умов.
Таблиця 4 Результати характеристики нового піку з часом утримування приблизно 2,71 хвилини та піку BDDE з часом утримання 3,47 хвилини
Примітка. Для отримання цих результатів аналізи РХ-МС і ВЕРХ (MRM і PIS) були виконані на двох піках.Для ВЕРХ аналізу використовується УФ детекція з довжиною хвилі 200 нм.
Скорочення: BDDE, 1,4-бутандіол дигліцидиловий ефір;HPLC, високоефективна рідинна хроматографія;РХ-МС, рідинна хроматографія та мас-спектрометрія;MRM, моніторинг множинної реакції;m/z, відношення маси до заряду;PIS, іонне сканування продукту;ультрафіолет, ультрафіолет.
Примітка. Фрагменти маси отримані методом РХ-МС (PIS).Верхня хроматограма: мас-спектр фрагментів стандартного зразка BDDE.Нижня хроматограма: мас-спектр нового виявленого піку (RRT, пов’язаний з піком BDDE, становить 0,79).BDDE обробляли в 1% розчині NaOH і автоклавували.
Скорочення: BDDE, 1,4-бутандіол дигліцидиловий ефір;РХ-МС, рідинна хроматографія та мас-спектрометрія;MRM, моніторинг множинної реакції;PIS, іонне сканування продукту;RRT, відносний час утримання.
Рисунок 7. Іонна хроматограма іона-попередника 203,30 Да та (A) новий пік із часом утримування 2,71 хвилини та (B) УФ-виявлення еталонного стандартного піку BDDE на 3,46 хвилині при 200 нм.
У всіх створених гідрогелях з перехресно зшитою ГК спостерігалося, що залишкова концентрація BDDE після кількісного визначення РХ-МС була <2 ppm, але в аналізі з’явився новий невідомий пік.Цей новий пік не відповідає стандартному продукту BDDE.Стандартний продукт BDDE також пройшов такий самий аналіз якості (конверсія MRM 203,30/129,10 Da) у позитивному режимі MRM.Як правило, інші аналітичні методи, такі як хроматографія, використовуються як граничні тести для виявлення BDDE в гідрогелях, але максимальна межа виявлення (LOD) трохи нижча за 2 ppm.З іншого боку, досі ЯМР та МС використовувалися для характеристики ступеня зшивання та/або модифікації ГК у фрагментах цукрових одиниць продуктів зшитого ГК.Метою цих методів ніколи не було кількісне визначення залишкового BDDE при таких низьких концентраціях, як ми описуємо в цій статті (LOD нашого методу LC-MS = 10 ppb).
Час публікації: 01 вересня 2021 р